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アイテム
妊娠認識物質ウシインターフェロン（bIFN）τの大量生産・精製 ：胚妊発育促進への適用
https://doi.org/10.24514/00002071
https://doi.org/10.24514/000020712b185da9-f2da-4971-b86d-ec6ddc09516d
| 名前 / ファイル | ライセンス | アクション |
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ilgs_report_No6p11-47p (46.0 MB)
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| Item type | 紀要論文01 / Departmental Bulletin Original Article(1) | |||||
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| 公開日 | 2019-03-22 | |||||
| タイトル | ||||||
| タイトル | 妊娠認識物質ウシインターフェロン（bIFN）τの大量生産・精製 ：胚妊発育促進への適用 | |||||
| タイトル | ||||||
| タイトル | Large-Scale Production and Purification of Biological Active Bovine Interferon τ：Possible Application to Increase Embryonic Development | |||||
| 言語 | en | |||||
| 言語 | ||||||
| 言語 | eng | |||||
| キーワード | ||||||
| 主題Scheme | Other | |||||
| 主題 | ウシインターフェロンτ | |||||
| キーワード | ||||||
| 主題Scheme | Other | |||||
| 主題 | 大量生産 | |||||
| キーワード | ||||||
| 主題Scheme | Other | |||||
| 主題 | 胚発育 | |||||
| キーワード | ||||||
| 主題Scheme | Other | |||||
| 主題 | 放射免疫測定法 | |||||
| キーワード | ||||||
| 言語 | en | |||||
| 主題Scheme | Other | |||||
| 主題 | Bovine interferon τ | |||||
| キーワード | ||||||
| 言語 | en | |||||
| 主題Scheme | Other | |||||
| 主題 | Large-scale production | |||||
| キーワード | ||||||
| 言語 | en | |||||
| 主題Scheme | Other | |||||
| 主題 | Embryonic development | |||||
| キーワード | ||||||
| 言語 | en | |||||
| 主題Scheme | Other | |||||
| 主題 | Radioimmunoassay | |||||
| 資源タイプ | ||||||
| 資源タイプ識別子 | http://purl.org/coar/resource_type/c_6501 | |||||
| 資源タイプ | departmental bulletin paper | |||||
| ID登録 | ||||||
| ID登録 | 10.24514/00002071 | |||||
| ID登録タイプ | JaLC | |||||
| 著者 |
高橋, ひとみ
× 高橋, ひとみ |
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| 抄録 | ||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||
| 内容記述 | In order to elucidate the source of the recent velvetleaf (Abutilon theophrasti) invasion and to understand the process of naturalization, I examined firstly intra-specific variation in morphological characters and growth habits, using accessions obtained from the USDA collection as well as from imparted grains. The best index of morphological variation was capsule color, either ivory or ebony. Variation in capsule color was found to be governed by nuclear gene(s), with ebony being dominant. Cluster analysis based on the ISSR polymorphism showed two major clusters that corresponded well with variation in capsule color. All six accessions obtained from imported grains united into one major cluster, while all of the old Japanese accessions occurred in another major cluster. A sequencing analysis of approx. 6% of the chloroplast genome detected two chloroplast DNA (cpDNA) haplotypes. By combining the cpDNA haplotypes with capsule color variation, I was able to classify all the accessions into three genotypes (Types I,Ⅱ and Ⅲ). Type Ⅱ was recognized as derived from the crossing of Type I(maternal) and Type Ill (paternal). All Japanese cultivars were identified as Type I, while USDA accessions included Types Ⅰ,Ⅱ and Ill. All the accessions obtained from imported grains and from the Corn Belt of the United States were Type Ill, and most of the accessions presently distributed in Japan were Type Ⅲ. A molecular genotyping method using historical herbarium specimens of velvetleaf was developed as a potential tool to understand the naturalization process of the species in Japan. PCR-based markers were shown to be applicable for genotyping the historical herbarium specimens. The earliest record of haplotypes B was in 1893 in Tokyo. Most of the accessions obtained from fields of Japanese forage crops were classified as Type Ⅲ, which had the cpDNA haplotype of the accessions obtained from seeds mixed with imported grains. The result appears to strongly support the hypothesis that the recent weedy velvetleaf occurring in Japan was derived from seeds mixed in with imported grains. However, it was found that Type Ⅱ, which had a different cpDNA haplotype from Type III, also occurred sporadically in Japan. In addition, Type Ill was also found in herbarium specimens collected 110 years ago. These facts suggest that seeds contaminating imported grains might not be the only source of recent weedy velvetleaf Japanese forage crop fields. | |||||
| 抄録 | ||||||
| 内容記述タイプ | Abstract | |||||
| 内容記述 | 本研究では．主要な妊娠認識物質であるウシインターフェロン（bIFN）τを大量生産ならびに精製し. 胚歪発育促進への適用について研究することを目的とした。1）パキュロウイルス／細胞系を用いたbIFNτの発現と生理活性 ウシIFN(bIFN）τを，体外受精由来ウシ栄養膜細胞より得た遺伝子をもとにAutographa californica nuclear poly-hedrosis virus発現系（Ac：バキュロウイルス／細胞系）により作出した。得られたAc-recombinant(r) bIFNτは高い抗ウイルス活性(1×10⁸IU/mL)を示し，イミュノブロットから分子量 23 kDaと推定された。培養ウシ子宮内膜上皮細胞にAc-rbIFNτ あるいはプロスタグランディン（PG)F2a. 刺激物質として知られているオキシトシン（OT, 100 nM）を単独または組合わせて添加し， 24時間のPGF2a，合成量の変化を検討した。 Ac-rbIFNτ(1-1,000 ng/mL）は PGF2aの基礎分泌およびOTに誘導されるPGF2a産生を抑制した。これらの結果から、バキュロウイルス／細胞系により作出したAc-rbIFNτは生理活性を有していることが明らかとなった。2）バキュロウイルス／カイコ系を用いたbIFNτ大量精製法の確立 Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus 発現系（Bm：バキュロウイルス／カイコ系）を利用してbIFNτを大量精製する手法を開発した。bIFNτのcDNAを組み込んだ組換えバキュロウイルスをカイコに感染させることにより，Bm-rbIFNτが効率良く生産され，体液中に蓄積した。大量生産に適した精製法を確立するため，Q-セファロ←スカラム（QSCC）とキレートセファロースカラム（CSCC）を組み合わせた精製の前処理として3種類の粗精製法，すなわち酸中和処理（ANT），シリカゲルカラム処理（SGCC), Blueセファロースカラム処理（BSCC）について検討したところ，酸中和処理が最も有効で経済的な手法であった。100頭のカイコより，純度約 91%のBm-rbIFNτを約4.55mg(1.26 ×10⁸ IU/mg）精製できたことから，この方法が大量精製に利用できることが礁認された。 3）ウシ胚の初期発生に及ぼすbIFNτの作用 ウシ胚の初期発生に及ぼすlFNτの作用機構について検討した。体外受精後5日日の桑実胚期にAc-rbIFNτを添加して培養し，発生率を検討したところ，無添加区と比較してAc-rbIFNτ添加区では胚盤胞期への発生率が有意に高まった。Ac-rblFNτ添加による胚発生促進効果は，培養液の違い，血清あるいはBSA添加の有無による影響を受けなかった。大腸菌発現系により作出されたEc-rbIFNτも同様に胚発生促進作用を有していた。IFNτの作用がtype ⅠIFNレセプター（IFNRI)を介して働くことを確認するため， IFNτと同種に属するIFNτを培養液に添加したところ，発生促進が見られたが，IFNτに比べて高濃度を要した。RT-PCRによりIFNRIサブユニットの発現を検討したところ，桑実期から胚盤胞期胚において発現が確認された。以上の結果から，IFNτはレセプターを介してオートクライン的な作用形態をもつホルモンとして発生促進作用を有することが示唆された。 4) bIFNτ特異的放射免疫測定法の確立 発生から着床までの限られた期間に，ウシ胚からのbIFN分泌は劇的に変化するものと推察されている。しかし，bIFNτに特異的な測定系は確立されておらず，胚発生における生理的なblFNτ分泌動態は不明である。そこで， bIFNτに特異的な放射免疫測定系（RIA）について検討した。Ac-rbIFNτを家兎に免疫し bIFNτのポリクロナール抗体を調整した。クロラミンT法によりAc-rbIFNτを125Iで標識し，Bm-rbIFNτを標品とした二抗体法によりRIAを行った。7.8-1,000ng/mLの範囲で良好な標準曲線が得られ，測定感度は 0.3 ng/tube (6.1 ng/mL）であった。7.8 ng/mLでの測定内変動係数は 7.1%, 測定問変動係数は11.0%であった。bIFNτの類縁物質であるrbIFNα，組換え ヒトIFNβ，組換えヒツジIFNτとの交差反応は認められず，栄養膜細胞培養後上清の段階希釈液と標準曲線が平行し，平均添加回収率は105%と良好であった。発情周期ならびに妊娠16日目のウシ子宮灌流サンプルへの適用結果より，本測定が有効であることが示された。本研究で確立したRIAはbIFNτの測定系として広く利用できるものと考えられる。 以上の研究より，blFNτ が糖鎖修飾を有するタンパク質であるため，糖鎖修飾機構を有するバキュロウイルス発現系を用いてAutographa californica nuclear polyhedrosis virus 発現系（Ac；バキュロウイルス／細胞系）よりAc-rbIFNτを，Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus 発現系（Bm：バキュロウイルス／カイコ系）よりBm-rbIFNτの大量発現・精製システムを確立し，これらのrbIFNτが糖鎖修飾されたタンパク質であること，ならびにin vitroにおいて生理活性を保持していることを確認した。また，bIFNτがウシ胚における初期発生の促進作用を有することを見出すとともに，着床前の桑実期胚においてIFNRI 発現を確認した。 これらの知見は， bIFNτがIFNRIを介して胚発生促進作用を有することを示唆している。さらに，本研究において作出したbIFNτを用いて，bIFNτの特異的放射免疫測定法を確立した。今後，胚発生に伴うbIFNτの分泌動態をこの測定系により解析し，早期胚死滅などに関与しているであろうblFNτの推移を明らかにすることでウシの受胎率向上技術の開発に役立つことが期待される。 | |||||
| 書誌情報 |
畜産草地研究所研究報告 en : Bulletin of National Institute of Livestock and Grassland Science 巻 6, p. 11-47, 発行日 2006-03-15 |
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| 出版者 | ||||||
| 出版者 | 独立行政法人 農業・生物系特定産業技術研究機構 | |||||
| ISSN | ||||||
| 収録物識別子タイプ | ISSN | |||||
| 収録物識別子 | 1347-0825 | |||||
| DOI | ||||||
| 関連タイプ | isIdenticalTo | |||||
| 識別子タイプ | DOI | |||||
| 関連識別子 | 10.24514/00002071 | |||||
| 著者版フラグ | ||||||
| 出版タイプ | VoR | |||||
| 出版タイプResource | http://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85 | |||||
